无细胞百日咳抗原蛋白的分离纯化方法

来自 : www.xjishu.com/zhuanli/05/0215 发布时间：2021-03-24

专利名称：无细胞百日咳抗原蛋白的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种柱层析法分离纯化无细胞百日咳抗原的工艺方法，尤其涉及一种采用经筛选的国产珍珠岩作为柱层析材料，对百日咳包特氏杆菌培养液的上清液进行一步分离纯化百日咳抗原的方法。
背景技术：
百日咳在四岁以下儿童群体中发病率和死亡率都很高，据统计每年有四千万儿童被感染，其中大约有九十五万儿童因为未注射百日咳疫苗而患病死亡。全球范围内大约每年使用十亿支百日咳疫苗。其中纯化的无细胞百日咳疫苗共有8000多万支。
各国使用全细胞百日咳疫苗已有数十年，由于注射疫苗后可能引起不同程度的发烧、呕吐、注射部位红肿等症状的副反应，个别的还可能产生较严重的脑神经症，甚至死亡。因此有些国家如英国、瑞典和日本曾停止接种全细胞百日咳疫苗，但随后发生了百日咳流行，教训深刻。因此上个世纪八十年代，日本首先开始试制无细胞百日咳疫苗，它是从百日咳包特氏杆菌胞外分泌液中提取出的抗原蛋白，含有丝状血凝素(FHA)和去毒的百目咳毒素(PT)。
日本的纯化工艺基本上包含硫酸铵沉淀，高盐浓度抽取和蔗糖梯度超离心(Noble et al.，1987 J.Am.Med.Assoc.257，1351-1356.)。经这套工艺生产的产品纯度不够高，产率较低而且设备投资巨大，不宜大规模生产。我国各生物制品公司目前仍沿用日本的无细胞百日咳生产工艺进行小批量生产。
过去20年中，北美和欧洲各国纷纷研制无细胞百日咳疫苗，制备工艺包括以下几种1.羟基磷灰石，结合珠蛋白柱层析和凝胶过滤法。
2.蓝胶亲和层析和胎球蛋白亲和层析法。
3.蓝胶亲和层析和羟基磷灰石层析法。
虽然使用这些工艺都可得到较纯的百日咳抗原PT和FHA，但每种工艺都有其不可避免的问题。例如蓝胶亲和层析、胎球蛋白亲和层析、结合珠蛋白亲和层析法，层析填料的结合基团容易降解下来而影响疫苗质量。另外，洗脱液中含有毒性物质或者洗脱条件过于苛刻，这些都会直接影响抗原产率和质量。
加拿大Connaught公司最早采用珍珠岩柱层析和羟基磷灰石柱层析法来纯化无细胞百日咳抗原(U.S.Pat.No.4,997,915)，可获得较高纯度和产率的PT和FHA，是目前国外各公司所用的较佳工艺。但菌苗培养物经珍珠岩柱层析分离纯化后，PT和FHA的纯度只能达到62％-68％，还要经过羟基磷灰石(Hydroxyapatite)柱层析分离纯化，PT和FHA的纯度才能达到90％左右。羟基磷灰石价格十分昂贵(约4,700美元/公斤)，并且这步分离纯化PT和FHA的收率约为90％，有大约10％的PT和FHA损失掉。
国外报道所用的珍珠岩是加拿大Filchem公司的产品，价格约6美元/公斤，如选用进口珍珠岩，不但要花费外汇去购买，分离纯化蛋白质的效果也较国产珍珠岩差。国产珍珠岩虽然货源充足、价格便宜(1.5-3.0元人民币/公斤)、产品性能稳定，但目前只用做助滤剂，国内尚无利用珍珠岩分离纯化蛋白质的报道。

发明内容
本发明提供了一种分离纯化无细胞百日咳抗原的简便工艺方法，本发明采用一种经筛选的国产珍珠岩作为柱层析材料，优化工艺条件对百日咳包特氏杆菌培养液的上清液进行一步分离纯化百日咳抗原，是一种简单、快速、低成本的无细胞百日咳疫苗的纯化方法。
本发明是通过如下步骤实现的(1)装柱选取含SiO270-80％，Al2O310-20％的食用类中速型珍珠岩，颗粒范围在30-250μm。扫描电镜观察、筛选表面不规则，具有多微孔结构的产品。去除悬浮物和悬浊液后，用注射用水冲洗珍珠岩层析柱；(2)样品处理，加样百日咳包特氏杆菌的培养液经高速离心去除菌体收集上清液，上清液经膜除菌过滤去除残余菌体，除菌后滤液经10-30KD膜包超滤浓缩至原体积的0.1-20％，浓缩液加入注射用水调整电导至2-4mS/cm，以线性流速小于300cm/hr通过珍珠岩层析柱。
(3)洗脱首先用50-60mM的Tris-HCl，pH＝7.0-8.0，对珍珠岩层析柱进行洗脱，直至洗脱液的OD值为0-0.05；第二步用含有0.05-0.15M NaCl的50-60Mm Tris-HCl缓冲液，pH＝7.0-8.0，对珍珠岩层析柱进行二次洗脱，直至洗脱液的OD值为0-0.05，收集第二步的洗脱液即为珍珠岩层析柱分离纯化的百日咳毒素；第三步用含有0.4-0.7M NaCl的50-60mM Tris-HCl，pH＝7.0-8.0对珍珠岩层析柱进行第三次洗脱，直至洗脱液的OD值为0-0.05，收集第三步的洗脱液即为珍珠岩层析柱分离纯化的丝状血凝素。
所述步骤(1)中优选珍珠岩的颗粒范围在50-250μm。
在一个较佳实施例中所述步骤(2)中滤液浓缩至原体积的10-20％。
步骤(2)中为了使蛋白质的吸附效果好，流速越慢越好，但为减少操作时间、防止蛋白凝聚，选用线性流速150-250cm/hr较为适宜。
采用国内分离筛选的百日咳杆菌CS菌株，它是属于1，2，3血清型的。其它百日咳包特氏杆菌菌株也可使用。
我们在实验中发现珍珠岩有着不同的化学组成和物理性能，其颗粒大小、表面结构等因素不同对各种蛋白质的吸附能力和洗脱条件也不同。本发明用筛选过的国产珍珠岩作为层析材料，可以有效地分离纯化百日咳抗原。国产珍珠岩(食用类)，颗粒范围一般为3-250μm。根据性能指标的不同，珍珠岩型号可分为快速(K)中速(Z)和慢速(M)型(中华人民共和国建材行业标准JC849-1999，珍珠岩助虑剂)。选用中速食用类珍珠岩更适宜从百日咳包特氏杆菌培养液中分离纯化丝状血凝素(FHA)和百日咳毒素(PT)。颗粒范围在30-250μm，分离纯化效果较好，用标准筛去除过小和过大颗粒珍珠岩，使珍珠岩颗粒均一，试验表明颗粒不均的珍珠岩对蛋白质的吸附和洗脱速率不同，从而导致分离纯化效果不好。对筛分过的珍珠岩颗粒用去离子水或蒸馏水冲洗、静置后去除悬浮物和悬浊液，进行多次反复后装入层析柱，用2-10倍的注射用水(WFI)冲洗珍珠岩层析柱。
经珍珠岩层析柱分离纯化的丝状血凝素(FHA)和百日咳毒素(PT)抗原溶液，经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定(中国生物制品规程，2000年版，吸附无细胞百日咳、白喉、破伤风联合疫苗制造及检定规程)分离纯化蛋白质的纯度，纯度达85-95％。
本发明涉及的技术选用筛选过的国产珍珠岩作为层析材料，用国内现行生产无细胞百日咳的生产菌株进行液体培养，采用本发明涉及的纯化工艺一步分离纯化百日咳抗原获得了良好的效果。和国内外同类技术相比具有如下优点1.本发明用筛选过的国产珍珠岩作为层析材料，可以有效地分离纯化百日咳抗原。国产珍珠岩价格便宜，每公斤1.5-3.0元人民币，与国外的同等材料相比，价格相差20-30倍。且分离纯化百日咳抗原的效果大大优于国外同类产品。
2.用本发明涉及的方法进行柱层析一步分离百日咳抗原，每吨百日咳包特氏杆菌培养液的产率由国内现有的6.7万人份提高到50万人份。经SDS-PAGE鉴定，纯度达85-95％，该项目产品的技术性能已达到并超过了国外同类产品水平。与国外报道珍珠岩柱层析和羟基磷灰石柱层析法来纯化无细胞百日咳抗原方法(U.S.Pat.No.4,997,915)相比，省略了羟基磷灰石柱层析二次分离纯化的工艺步骤。节省了时间，省去了相应的设备和价格昂贵的原料，大幅度地降低生产成本。为生产企业提供了一种简单、快速的无细胞百日咳疫苗的纯化方法。
3.用筛选过的国产珍珠岩进行柱层析一步分离的百日咳抗原的方法，与国内现有的硫酸铵沉淀，高盐浓度抽取和蔗糖梯度超离心方法分离纯化无细胞百日咳的疫苗产品相比，产率提高6-10倍，纯度提高5倍。为全面革新我国无细胞百日咳疫苗的生产工艺奠定了坚实的基础。
4.本发明涉及的分离纯化百日咳抗原的珍珠岩柱层析法，具有工艺简便、分离效果好的优点，工艺全过程可在封闭系统中连续进行，可实现过程自动控制，适于大规模连续生产的要求。
5.本发明中使用的百日咳包特氏杆菌菌株，是我国早已应用的CS菌株，属于1，2，3血清型。其它的百日咳包特氏杆菌，只要生产抗原的产量适合也可使用。分离纯化后的PT和FHA经解毒后可按比例混合单独作为无细胞百日咳疫苗，也可与其他疫苗按比例混合制成联合疫苗。
图1为实施例1中的洗脱图谱图2为实施例2中的洗脱图谱图3SDS-PAGE鉴定分离百日咳抗原的纯度其中1为低分子量MARK蛋白样品，分子量分别为116，66，45，35，25，18，14kDa；2为珍珠岩柱层析分离纯化的FHA；3为珍珠岩柱层析分离纯化的PT；4为百日咳包特氏杆菌的培养液的超滤浓缩液.
具体实施例方式
实施例1选取国产食用类中速型珍珠岩(内蒙古赤峰珍珠岩厂)，含SiO272％，Al2O310％，用标准筛去除过小和过大颗粒珍珠岩，得到颗粒范围在50-125μm。对筛分过的珍珠岩颗粒用蒸馏水冲洗、静置后去除悬浮物和悬浊液，进行多次反复后装入层析柱(北京宾达英创科技有限公司，内径210mm)装填高度300mm，用5倍的注射用水(WFI)冲洗珍珠岩层析柱。
打开百日咳包特氏杆菌CS菌株冻干的安瓶，将内含物撒在无菌水里，并用移液管把它移置于含有半综合活性炭琼脂培养基上，在37℃下培养72小时。将有机体传代移置上述培养基上37℃培养48小时，如此扩增3-4代。
然后将这些有机体刮在含有25L液体环糊精培养基(modified Frohlichmedium)的种子罐里，通气搅拌培养36小时。接种到250L液体环糊精培养基(modified Frohlich medium)的发酵罐里，通气搅拌培养36小时。百日咳包特氏杆菌的培养液经高速离心去除菌体，收集上清液。
上清液经0.22μm膜除菌过滤去除残余菌体。除菌后滤液经10KD膜包超滤浓缩至25L。百日咳抗原的浓缩液加入WFI调整电导至3-4ms/cm。匀速通过珍珠岩层析柱，线性流速为150cm/hr。
用280nm波长的紫外检测仪对珍珠岩层析柱的洗脱液进行在线检测，记录仪打印的紫外检测曲线见图1。首先用51mM的Tris-HCl，pH＝8.0，对珍珠岩层析柱进行洗脱，直至洗脱液的OD值为0-0.05，见图1中峰1。第二步用含有0.1M NaCl的51mM Tris-HCl，pH＝8.0，对珍珠岩层析柱进行第二次洗脱，直至洗脱液的OD值为0-0.05，收集第二步的洗脱液即为珍珠岩层析柱分离纯化的百日咳毒素(PT)，见图1中峰2。第三步用含有0.5MNaCl的51mM Tris-HCl，pH＝8.0，对珍珠岩层析柱进行第三次洗脱，直至洗脱液的OD值为0-0.05，收集第三步的洗脱液即为珍珠岩层析柱分离纯化的丝状血凝素(FHA)，见图1中峰3。
实施例2选取国产食用类中速型珍珠岩(河南省信阳珍珠岩厂)，含SiO280％，Al2O320％，用标准筛去除过小和过大颗粒珍珠岩，得到颗粒范围在125-250μm。对筛分过的珍珠岩颗粒用蒸馏水冲洗、静置后去除悬浮物和悬浊液，进行多次反复后装入层析柱(北京宾达英创科技有限公司，内径210mm)装填高度300mm，用5倍的注射用水(WFI)冲洗珍珠岩层析柱。
打开百日咳包特氏杆菌CS菌株冻干的安瓶，将内含物撒在无菌水里，并用移液管把它移置于含有半综合活性炭琼脂培养基上，在37℃下培养72小时。将有机体传代移置上述培养基上37℃培养48小时，如此扩增3-4代。
然后将这些有机体刮在含有25L SSM综合培养基(modified Stainer-Scholte medium)的种子罐里，通气搅拌培养36小时。接种到250L SSM综合培养基(modified Stainer-Scholte medium)的发酵罐里，通气搅拌培养36小时。百日咳包特氏杆菌的培养液经高速离心去除菌体，收集上清液。
上清液经0.22μm膜除菌过滤去除残余菌体。除菌后滤液经30KD膜包超滤浓缩至25L。百日咳抗原的浓缩液加入WFI调整电导至2-3mS/cm。匀速通过珍珠岩层析柱，线性流速为250cm/hr。
用280nm波长的紫外检测仪对珍珠岩层析柱的洗脱液进行在线检测，记录仪打印的紫外检测曲线见图1。首先用55mM的Tris-HCl，pH＝7.5，对珍珠岩层析柱进行洗脱，直至洗脱液的OD值为0-0.05，见图2中峰1。第二步用含有0.05M NaCl的55mM Tris-HCl，pH＝7.5，对珍珠岩层析柱进行第二次洗脱，直至洗脱液的OD值为0-0.05，收集第二步的洗脱液即为珍珠岩层析柱分离纯化的百日咳毒素(PT)，见图2中峰2。第三步用含有0.4M NaCl的55mM Tris-HCl，pH＝7.5，对珍珠岩层析柱进行第三次洗脱，直至洗脱液的OD值为0-0.05，收集第三步的洗脱液即为珍珠岩层析柱分离纯化的丝状血凝素(FHA)，见图2中峰3。
实施例3对珍珠岩层析柱洗脱液的三个紫外光吸收峰的收集液分别测血凝活力。
采集新鲜公鹅血5ml，加10ml 0.9％NaCl溶液，均匀后离心弃去上清，再加10ml 0.9％NaCl溶液洗，共洗3次。再用0.9％NaCl溶液将鹅血配成0.8％的红血球悬浮液。
在血球凝集板上加入40μl 0.9％生理盐水，再加40μl待测样品做倍倍稀释，最后加入40μl 0.8％红血球悬浮液，充分振荡，室温下放置30分钟，实验结果列于表1。从表1可以看出，珍珠岩分离纯化的百日咳抗原峰2、峰3收集液具有较高的血凝活性，峰2收集液血凝活性达1∶2048和1∶1024；峰3收集液血凝活性达1∶8192和1∶2048。由此可证明峰2、峰3收集液具有抗原活性，是分离纯化的目的产物百日咳抗原蛋白。峰1含极低的血凝活性，分别为1∶8和1∶4。由此可证明峰1收集液具有极低抗原活性，为杂蛋白。
表1.吸收峰蛋白质浓度及其血凝活性

实施例4分别将获得的各峰值蛋白溶液收集于一体，用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定分离百日咳抗原的纯度见图3。与标准低分子量MARK蛋白的电泳图谱对照比较可知，国产珍珠岩柱层析分离的百日咳抗原吸收峰1是杂蛋白；峰2为珍珠岩柱层析分离纯化的PT；峰3为珍珠岩柱层析分离纯化的FHA。其中分离纯化的PT和FHA蛋白质纯度达90％以上。由表1中各吸收峰蛋白质浓度经计算可知，PT的平均产率为21.93μg/ml；FHA的平均产率为24.76μg/ml。
权利要求
1.一种无细胞百日咳抗原蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤(1)装柱选取含SiO270-80％，Al2O310-20％的食用类中速型珍珠岩，颗粒范围在30-250μm，去除悬浮物和悬浊液后，用注射用水冲洗珍珠岩层析柱；(2)样品处理，加样百日咳包特氏杆菌的培养液经高速离心去除菌体收集上清液，上清液经膜除菌过滤去除残余菌体，除菌后滤液经10-30KD膜包超滤浓缩至原体积的0.1-20％，浓缩液加入注射用水调整电导至2-4mS/cm，以线性流速小于300cm/hr通过珍珠岩层析柱；(3)洗脱首先用50-60mM的Tris-HCl缓冲液，pH＝7.0-8.0，对珍珠岩层析柱进行洗脱，直至洗脱液的OD值为0-0.05；第二步用含有0.05-0.15M NaCl的50-60mM Tris-HCl缓冲液，pH＝7.0-8.0，对珍珠岩层析柱进行二次洗脱，直至洗脱液的OD值为0-0.05，收集第二步的洗脱液即为珍珠岩层析柱分离纯化的百日咳毒素；第三步用含有0.4-0.7M NaCl的50-60mM Tris-HCl缓冲液，pH＝7.0-8.0，对珍珠岩层析柱进行第三次洗脱，直至洗脱液的OD值为0-0.05，收集第三步的洗脱液即为珍珠岩层析柱分离纯化的丝状血凝素。
2.如权利要求1所述的无细胞百日咳抗原蛋白的分离纯化方法，其特征在于步骤(1)中珍珠岩的颗粒范围在50-250μm。
3.如权利要求1所述的无细胞百日咳抗原蛋白的分离纯化方法，其特征在于步骤(2)中滤液浓缩至原体积的10-20％。
4.如权利要求1所述的无细胞百日咳抗原蛋白的分离纯化方法，其特征在于步骤(2)中浓缩液通过珍珠岩层析柱的线性流速为150-250cm/hr。
全文摘要
本发明涉采用一种对百日咳包特氏杆菌培养液的上清液进行一步分离纯化百日咳抗原的方法。本发明的制备工艺采用经筛选的国产珍珠岩作为柱层析材料，样品经浓缩调整电导处理后，优化洗脱条件可一步分离纯化得到丝状血凝素(FHA)和百日咳毒素(PT)；经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)鉴定，纯度达85－95％。本发明的工艺方法大幅减化了纯化工艺步骤，节省了时间，省去相应的设备和价格昂贵的原料，不仅大幅度地降低生产成本而且显著提高了产品质量和收率，是一种简单、快速的无细胞百日咳疫苗的分离纯化方法。
文档编号A61K39/10GK1504482SQ02153660
公开日2004年6月16日 申请日期2002年12月3日 优先权日2002年12月3日
发明者孙世章, 李贵凡, 宫慧梅, 孙雪南 申请人:北京优力凯生物技术有限责任公司